IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase substrate جو هڪ اينالاگ آهي، جيڪو تمام گهڻو inducible آهي. IPTG جي induction جي تحت، inducer repressor پروٽين سان هڪ ڪمپليڪس ٺاهي سگهي ٿو، ته جيئن repressor پروٽين جي conformation تبديل ٿي وڃي، ته جيئن ان کي ٽارگيٽ جين سان گڏ نه ڪري سگهجي، ۽ ٽارگيٽ جين کي موثر طريقي سان ظاهر ڪيو وڃي. تنهن ڪري تجربي دوران IPTG جي ڪنسنٽريشن ڪيئن طئي ڪئي وڃي؟ ڇا وڏو اوترو بهتر آهي؟
پهرين، اچو ته IPTG انڊڪشن جي اصول کي سمجهون: E. coli جي ليڪٽوز اوپيرون (عنصر) ۾ ٽي ساختياتي جين، Z، Y، ۽ A شامل آهن، جيڪي ترتيب وار β-galactosidase، permease، ۽ acetyltransferase کي انڪوڊ ڪن ٿا. lacZ ليڪٽوز کي گلوڪوز ۽ گليڪٽوز، يا allo-lactose ۾ هائيڊولائيز ڪري ٿو؛ lacY ماحول ۾ ليڪٽوز کي سيل جھلي مان گذرڻ ۽ سيل ۾ داخل ٿيڻ جي اجازت ڏئي ٿو؛ lacA ايسٽيل گروپ کي ايسٽيل-CoA کان β-galactoside ڏانهن منتقل ڪري ٿو، جنهن ۾ زهر جي اثر کي ختم ڪرڻ شامل آهي. ان کان علاوه، هڪ آپريٽنگ تسلسل O، هڪ شروعاتي تسلسل P ۽ هڪ ريگيوليٽري جين I آهي. I جين ڪوڊ هڪ ريپريسر پروٽين آهي جيڪو آپريٽر تسلسل جي پوزيشن O سان ڳنڍيل ٿي سگهي ٿو، ته جيئن اوپيرون (ميٽا) کي دٻايو ۽ بند ڪيو وڃي. شروعاتي تسلسل P جي اپ اسٽريم ۾ ڪيٽابولڪ جين ايڪٽيويٽر پروٽين-سي اي پي بائنڊنگ سائيٽ لاءِ هڪ بائنڊنگ سائيٽ پڻ آهي. پي تسلسل، او تسلسل ۽ سي اي پي بائنڊنگ سائيٽ گڏجي لاک اوپيرون جو ريگيوليٽري علائقو ٺاهيندا آهن. ٽنهي اينزائمز جي ڪوڊنگ جينز کي جين پراڊڪٽس جي هم آهنگ اظهار حاصل ڪرڻ لاءِ ساڳئي ريگيوليٽري علائقي پاران منظم ڪيو ويندو آهي.
ليڪٽوز جي غير موجودگيءَ ۾، لاک اوپرون (ميٽا) دٻاءُ جي حالت ۾ هوندو آهي. هن وقت، PI پروموٽر تسلسل جي ڪنٽرول هيٺ I تسلسل ذريعي ظاهر ڪيل لاک ريپريسر O تسلسل سان ڳنڍيل هوندو آهي، جيڪو RNA پوليمريز کي P تسلسل سان ڳنڍڻ کان روڪيندو آهي ۽ ٽرانسڪرپشن جي شروعات کي روڪيندو آهي؛ جڏهن ليڪٽوز موجود هوندو آهي، ته لاک اوپرون (ميٽا) کي متحرڪ ڪري سگهجي ٿو. هن اوپرون (ميٽا) سسٽم ۾، حقيقي انڊيڪر پاڻ ليڪٽوز نه هوندو آهي. ليڪٽوز سيل ۾ داخل ٿئي ٿو ۽ β-galactosidase ذريعي ڪيٽيلائيز ڪيو ويندو آهي ته جيئن ايلوليڪٽوز ۾ تبديل ٿي وڃي. بعد ۾، هڪ انڊيڪر ماليڪيول جي طور تي، ريپريسر پروٽين سان ڳنڍيل هوندو آهي ۽ پروٽين جي شڪل کي تبديل ڪندو آهي، جيڪو ريپريسر پروٽين کي O تسلسل ۽ ٽرانسڪرپشن کان الڳ ڪرڻ جو سبب بڻجندو آهي. آئسوپروپيلٿيوگليڪٽوسائيڊ (IPTG) جو اثر ايلوليڪٽوز وانگر هوندو آهي. اهو هڪ تمام طاقتور انڊيڪر آهي، جيڪو بيڪٽيريا پاران ميٽابولائز نه ٿيندو آهي ۽ تمام مستحڪم هوندو آهي، تنهن ڪري اهو ليبارٽريز ۾ وڏي پيماني تي استعمال ٿيندو آهي.
IPTG جي بهترين ڪنسنٽريشن ڪيئن طئي ڪجي؟ مثال طور E. coli وٺو.
E. coli BL21 جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل اسٽرين جنهن ۾ مثبت ريڪومبيننٽ pGEX (CGRP/msCT) شامل آهي، ان کي 50μg·mL-1 Amp تي مشتمل LB مائع ميڊيم ۾ انوڪيليٽ ڪيو ويو، ۽ رات جو 37°C تي ڪلچر ڪيو ويو. مٿي ڏنل ڪلچر کي 50mL تازي LB مائع ميڊيم جي 10 بوتلن ۾ 50μg·mL-1 Amp تي 1:100 جي تناسب سان ايڪسپينشن ڪلچر لاءِ انوڪيليٽ ڪيو ويو، ۽ جڏهن OD600 جي قيمت 0.6~0.8 هئي، ته IPTG کي آخري ڪنسنٽريشن ۾ شامل ڪيو ويو. اهو 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، 0.6، 0.7، 0.8، 0.9، 1.0mmol·L-1 آهي. ساڳئي درجه حرارت ۽ ساڳئي وقت تي شامل ڪرڻ کان پوءِ، ان مان 1 ايم ايل بيڪٽيريا محلول ورتو ويو، ۽ بيڪٽيريا سيلز کي سينٽرفيوگيشن ذريعي گڏ ڪيو ويو ۽ SDS-PAGE جي تابع ڪيو ويو ته جيئن پروٽين جي اظهار تي مختلف IPTG ڪنسنٽريشن جي اثر جو تجزيو ڪري سگهجي، ۽ پوءِ سڀ کان وڏي پروٽين جي اظهار سان IPTG ڪنسنٽريشن چونڊيو وڃي.
تجربن کان پوءِ، اهو معلوم ٿيندو ته IPTG جي ڪنسنٽريشن ممڪن حد تائين وڏي نه آهي. اهو ئي سبب آهي جو IPTG ۾ بيڪٽيريا لاءِ هڪ خاص زهر آهي. ڪنسنٽريشن کان وڌيڪ ڪرڻ سان سيل کي به ماريو ويندو؛ ۽ عام طور تي، اسان اميد ڪريون ٿا ته سيل ۾ وڌيڪ حل ٿيندڙ پروٽين جو اظهار ڪيو ويندو، اوترو بهتر، پر ڪيترن ئي ڪيسن ۾ جڏهن IPTG جي ڪنسنٽريشن تمام گهڻي هوندي، ته وڏي مقدار ۾ شموليت پيدا ٿيندي. جسم، پر حل ٿيندڙ پروٽين جي مقدار گهٽجي وئي. تنهن ڪري، سڀ کان وڌيڪ مناسب IPTG ڪنسنٽريشن اڪثر ڪري وڏو نه هوندو آهي، پر ڪنسنٽريشن گهٽ هوندو آهي.
جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل اسٽرين جي انڊڪشن ۽ پوک جو مقصد ٽارگيٽ پروٽين جي پيداوار وڌائڻ ۽ خرچ گهٽائڻ آهي. ٽارگيٽ جين جو اظهار نه رڳو اسٽرين جي پنهنجي عنصرن ۽ اظهار پلازمڊ کان متاثر ٿئي ٿو، پر ٻين ٻاهرين حالتن کان به متاثر ٿئي ٿو، جهڙوڪ انڊيڪر جي ڪنسنٽريشن، انڊڪشن جو گرمي پد ۽ انڊڪشن جو وقت. تنهن ڪري، عام طور تي، ڪنهن نامعلوم پروٽين کي ظاهر ڪرڻ ۽ صاف ڪرڻ کان اڳ، مناسب حالتن کي چونڊڻ ۽ بهترين تجرباتي نتيجا حاصل ڪرڻ لاءِ انڊڪشن جو وقت، گرمي پد ۽ IPTG ڪنسنٽريشن جو مطالعو ڪرڻ بهتر آهي.
پوسٽ جو وقت: ڊسمبر-31-2021